WB（WesternBlot）是一种常用的生物化学实验技术，用于检测和分析蛋白样品中特定蛋白质的存在和表达水平。它通过将样品中的蛋白质分离并转移到膜上，然后使用特定的抗体识别目标蛋白，并通过化学或免疫检测方法来可视化这些蛋白质。WesternBlot技术通常包括样品制备、SDS-PAGE电泳分离、蛋白转印、封闭和抗体检测、曝光显影等步骤。目前WB被广泛应用于生物医学研究中，用于研究蛋白质表达、翻译后修饰以及蛋白质相互作用等。

图1.WB流程图

在日常实验过程中，小分子蛋白是非常常见的，小分子蛋白是指待检测的蛋白分子量小于20kda，常见的凋亡蛋白如Bcl2、Caspase-3、Bax，自噬相关蛋白如LC3B等均为小分子蛋白，这类蛋白由于较小的分子量，易受到凝胶网孔的影响在电泳过程中弥散，导致难以分离和检测。因此，为了检测到小分子量的蛋白，需要对实验步骤进行一些优化，以提高实验成功率。

1. 配胶：整体配胶遵循蛋白分子量越小胶浓度越大的原则，对于小分子蛋白来说，分离胶浓度一般为12%-15%，对于小分子蛋白条带可以分的更加清晰。同时在倒胶时浓缩胶的比例可以适当增加到4：6，使其充分浓缩，后续电泳过程中一定程度上可以减少弥散。15-20kda可选择12%的凝胶；10-15kda可选择13.5%的凝胶；小于10kda的蛋白用15%的凝胶或者用Tricine-SDS-PAGE凝胶电泳体系。与传统的Gly-SDS-PAGE相比，Tricine-SDS-PAGE使用三羟甲基氨基甘氨酸（Tricine）代替甘氨酸（Gly），具有更好的小分子蛋白分离效果。

2. 上样：根据日常上样经验，建议在跑小分子蛋白时增加1倍上样量，防止蛋白弥散过多。选择marker时，选择适用于小分子蛋白的marker，后续敷抗体时可以更清楚的进行裁膜。电泳开始前可用1´loadingbuffer补齐未点样的胶孔，防止两边不齐跑成“八"字。

图1：赛默飞marker示意图（左：常规蛋白marker；右：小分子蛋白marker）

3. 电泳：浓缩胶部分设置恒压70V、30min左右，一般即可浓缩到一条线上之后调大电压至110V，至所需蛋白区域全部分开为止。尽量避免长时间低电压跑胶，易导致蛋白弥散过多。同时整个电泳过程中注意降温。

4. 转膜：由于小分子蛋白分子量小，吸附能力弱，因此转膜时选择0.22μm的PVDF膜，常规0.45μm膜容易穿透，剩余条件同正常蛋白一般可以满足条件。

5. 封闭：快速封闭液或脱脂牛奶按正常条件封闭即可。裁膜时根据marker上下留出足够多的空间。

6. 一抗孵育：在保证上述条件的基础上，一抗是出好结果的关键一步，若没前期实验经验，一抗的稀释比一般按照说明书配置，若有前期实验的经验，可适当进行比例调整，一抗浓度过高最后显影阶段易出现杂带，过低则可能看不到条带。使用1´TBST缓冲液稀释，4℃孵育过夜。

7. 后续二抗比例及孵育时间、显影按常规操作即可。需要注意若抗体不好用或者蛋白难出结果，在敷完一二抗时可适当延长洗膜时间及次数。

注意事项：

1. 转膜时，若蛋白分子量过小，可适当提高甲醇比例（30%左右）改善吸附能力。

2. 跑小分子蛋白时marker尽量不跑到一张膜上，对于常见内参GAPDH、Actin及Tubulin等来说，分离胶浓度大上述蛋白区域一般分不开或分离不完整，易导致内参不齐。

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