继推出《细胞培养过程中如何避免内毒素的不良影响》《细菌内毒素的检测方法》后，有没有小伙伴想知道细菌内毒素如何去除呢？今天让我们一起答疑解惑！

前言：19世纪，Ernstvon Bergmann提出了毒素的概念，他认为腐烂的液体含有一种水溶性但不溶于酒精、耐热、不挥发的物质，这种物质会引起疾病症状。20世纪初，Pfeie等学者提出了内毒素的名称，确定了整个细菌家族拥有基本相同的毒素，并发现了内毒素的热原性和毒性之间的密切关系。20世纪中叶，Lüderitz 和Westphal等学者从患者血清中分离出内毒素，而将多糖和脂质等非蛋白质的部分命名为脂多糖(LPS)。此后对内毒素脂多糖的化学表征发展迅速，相继开展内毒素脂多糖的核心多糖、空间结构、衍生物、类似物的化学合成和生物分析。细菌内毒素结构分为三个部分: 类脂A(Lipid A)、核心多糖(Corepolysaccharide)和一系列重复的氧多糖侧链(O-polysaccharide side chain)。

 细菌内毒素如何去除？

细菌内毒素，特别是脂多糖(LPS)，是革兰氏阴性细菌细胞壁的一种成分，对生物制品，尤其是基于大肠杆菌表达的病毒样颗粒(VLP)疫苗的生产构成了重大挑战。内毒素的复杂结构和稳定性使其难以通过常规纯化技术去除，且其生物活性强，即使是微量残留也可能对疫苗的安全性和有效性构成威胁。同时，内毒素不是蛋白质，其热稳定性使得它即使在100℃的高温下加热1小时也不会被破坏。在更高的温度(如115℃)下湿热处理30分钟，也只能破坏大约25%的热原质。为了ce di破坏内毒素的生物活性，需要采用更高的温度和更长的处理时间，如180℃下干烤3-4小时或250℃下干烤1-2小时。此外，强碱、强酸或强氧化剂加温煮沸30分钟才能有效破坏内毒素。以下介绍几种比较常见的去除细菌内毒素的方法。

1. 膜过滤法

膜过滤法是一种物理去除内毒素的方法。由于内毒素分子相对较大，通过选择合适的膜孔径和操作条件，可以实现内毒素的有效截留。然而，这种方法需要特别注意膜的选择和操作参数的优化，以避免对目标蛋白或VLP造成损失。

2. 亲和层析法

亲和层析法利用特定的层析介质对内毒素的亲和性进行去除。通过优化层析条件，如pH值和离子强度，可以进一步提高去除效率和降低蛋白损失。这种方法具有高效、选择性好的优点，但需要针对具体的生物制品进行优化。特别是免疫吸附剂在生产中的运用使得生物大分子的纯化变得简单。免疫吸附的原理基于抗原、抗体的特异性作用，以目标蛋白作为抗原，将通过杂交瘤技术生产的单克隆抗体偶联于介质上，此介质来吸附目标蛋白。由于相互作用的高度特异性，理论上仅有目标蛋白吸附于介质上，内毒素全部穿透，洗脱后将得到纯度很高的无热原产品。

实际上，由于介质本身存在的非特异性吸附，仍有少量的杂蛋白和内毒素同时被吸附，但内毒素含量是极低的。在干扰素(IFN)生产中，洗脱物内毒素含量一般为0.25EU/mL。

3. 密度梯度超离心法

密度梯度超离心法依据内毒素与其他溶液组分在密度、沉降系数等方面的差异进行分离。然而，由于内毒素的存在形式多样，这种方法的应用受到一定限制，且操作复杂，成本较高。

4. 活性炭吸附法

活性炭吸附法适用于小分子溶液或水中的内毒素去除。然而，它对有效成分也有吸附作用，且残留的活性炭不易去除，因此在实际应用中需要谨慎考虑。

5. 分子筛法(凝胶过滤层析)

分子筛法利用凝胶分子筛的空间网状结构进行过滤层析，适用于蛋白分子量较小的溶液。这种方法操作简便，但对内毒素的去除效率可能不如其他方法高。

内毒素可在水溶液中以非极性和离子相互作用，形成大小为1000kDa分子聚集体，它与多数生物蛋白分子量差异较大，基于这一特征，可以采用凝胶过滤层析，将大分子内毒素分子与目标蛋白分离。但其处理量小, 处理时间较长。

6. 化学处理法

化学处理法通过使用特定的化学物质，如Triton X-114进行两相分离，可以有效去除LPS。然而，这些化学物质可能会对VLP的结构造成损害，因此需要在使用前进行充分的评估和优化。

7. 离子交换层析法

LPS带有负电荷，因此可以通过离子交换层析法进行去除。这种方法操作简便，且对目标蛋白的损失较小。然而，需要针对具体的生物制品选择合适的离子交换介质和操作条件。

对于阴离子交换层析，内毒素在pH>2时带负电荷，与阴离子交换介质Q或DEAE有较强结合, 可使用目标蛋白从阴离子交换填料流穿的方式去除内毒素；也可在目标蛋白和内毒素同时结合于层析介质上后，由于内毒素的结合能力较蛋白的结合能力强，因此可先将目标蛋白洗脱出来，然后再用高盐缓冲液或NaOH将内毒素洗出。

对于阳离子交换层析，在pH4.0时，内毒素还是带有负电荷不能和填料结合而随流动相流出层析柱，目标蛋白则可以与阳离子交换介质结合，因此采用阳离子交换层析也可以很好的去除内毒素。此外，采用一些表面活性剂比如Triton X-114，既能阻止内毒素结合在阴离子柱上也可阻止内毒素结合在阳离子柱上。

8. 聚合物沉淀法

这种方法主要依赖于特定的聚合物，如聚乙二醇(PEG)，来沉淀出内毒素(如LPS)。这种方法操作简便，意味着它不需要复杂的设备或高深的技术知识。然而，要实现最佳效果，必须严格控制聚合物的浓度和操作条件。这是因为过高的浓度或不当的操作条件可能会对目标蛋白造成损失，从而影响最终产品的质量和纯度。

9. 遗传工程改造法

近年来，通过遗传工程改造大肠杆菌菌株，使其内毒素生物合成途径发生变化，从而产生脂质IVA而非完整的内毒分子，成为了一种新的去除内毒素的方法。脂质IVA是内毒素的前体，不会触发人类典型的内毒素反应，因此是生产治疗性蛋白的更安全选项。这种方法为生物制品的生产带来了重大进步，因为它可能消除了表达后进行昂贵且效率低下的内毒素去除过程的需求。

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