我们知道环境中广泛存在的格兰氏阴性菌容易污染生产过程，其裂解后会释放出内毒素，因内毒素耐热性和化学稳定性强而难以灭活，所以一旦有内毒素污染进入血液，即使极少量也能引起发热休克等严重反应，因而内毒素与其他已知热原污染物相比，显示更强的热原性。

而热原检测不同于无菌检测，两者应同时进行。无菌检测通常检测微生物产生的活生物体或孢子，但无法检测内毒素，只能进行热原检测。下面我们来简单了解有哪些检测细菌内毒素的不同方法有家兔热原检查法、凝胶法(鲎试剂)、光度测定法(鲎试剂)、重组C因子法等

一、家兔热原检查法

20世纪40年代，第12版美国药典中纳入了第一个基于兔子模型的热原实验。兔子热原测试是将样本注射到多只兔子体内，致热物质的存在导致兔子在注射3-6 h后发热。兔子热原试验(RPT)的基础是测量兔子在静脉内注射待测样品的无菌溶液后温度的升高。如果样品中含有热原，兔子的体温会升高0.6℃。

优点: 可以检测所有类型的热原物质；

缺点: 动物个体差异大导致检测灵敏度低；对于毒性大的药物如放射性药物或肿瘤抑制剂等，无法进行检测；定性而非定量方法，不能用于药品生产过程中的质量控制。

二、 鲎试剂检查法

20世纪70年代，分为凝胶法、浊度法和显色基质法。这是一种使用鲎变形细胞裂解物测定内毒素的体外方法。主要试剂鲎变形细胞裂解物(LAL)是从鲎(Limulus polyphemus)中提取的血细胞(变形细胞)的水提取物。鲎试剂法的反应机理是细菌内毒素在二价阳离子参与下激活鲎血细胞溶解物中的一系列凝聚酶的反应。

优点: 易操作，灵敏度高，可用于内毒素定量检测；

缺点: 鲎血批次间有差异；对革兰氏阴性菌以外的内毒素不灵敏；易受β-葡聚糖(β-Glucans)影响而产生假阳性；鲎受到动物保护，无法大批量供应。

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三、 重组C因子法

21世纪初，通过重组方法产生C因子。因子C是由内毒素结合激活的级联反应的第一个成分，C因子激活B因子。另一种替代途径是G因子被葡聚糖结合激活。C因子和G因子都将促凝血酶转变为凝血酶。C因子可以选择性地识别内毒素并触发蛋白酶级联反应。因子C已被纯化和克隆以创建内毒素特异性测定。

优点: C因子来源稳定，受批次影响小；操作简单快速；更强的抗干扰能力(不受β-glucans影响)；专属性好。

缺点: 来源于不同品种鲎血蛋白序列的重组蛋白对内毒素的反应性可能不同。

rFC检测的原理是内毒素结合会激活重组C因子。这种活性结合会裂解合成底物，从而产生荧光化合物，该测定在96孔板上进行。使用380/440nm的激发波长，在零时和37℃±1℃下孵育一小时后，在微孔板读数中测量荧光。对数净荧光(1 h和时间零读数之间的差异=ΔRFU)与对数内毒素浓度成正比，并且在0.005-5.0EU/ml范围内呈线性关系。

四、 单核细胞活化试验

单核细胞激活试验(MAT)有助于检测和量化激活人类单核细胞以释放负责发烧反应的介质的物质。该测试探索人类发烧反应，提供比RPT更好的热源活动信息。该测试不仅可以确定内毒素热原，还可以帮助确定非内毒素热原。

MAT测试可检测细胞因子、前列腺素(IL-1/IL-3)和由单核细胞激活的致热物质产生的肿瘤坏死因子α(TNF-α)。然后使用ELISA(酶联免疫吸附测定)检测这些白细胞介素。

MAT的一般原理为热原+人类白细胞→白细胞介素 →使用ELISA检测并以IU/ml进行定量。MAT的一般程序包括三个基本步骤: 激活单核细胞，孵育产生IL-6，并使用软件进行定量分析。

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