NEB-Q5定点突变试剂盒（不含感受态细胞）可以在 2 小时内快速对双链质粒DNA进行定点突变。该试剂盒使用稳定的Q5热启动超保真 DNA 聚合酶，结合客户自行设计的引物，在各种质粒中引入插入、缺失和替换突变。PCR 后将扩增材料直接添加到du特的激酶-连接酶-DpnI（KLD）酶混合液中，进行快速室温环化和模板去除（5 分钟）。操作方便、简单，只需一天时间便可完成整个操作，并且不受载体、宿主菌的限制。

操作使用：

步骤 I：指数扩增 （PCR）

1. 将以下试剂组装在薄壁PCR管中。

2. 将试剂wan全混合，然后转移到热循环仪中。

3. 执行以下循环条件： 常规PCR的热循环条件：

* 有关诱变引物的 Q5 优化退火温度，请使用在线 NEB 引物设计软件 NEBaseChanger™。对于预先设计的背靠背引物组，可以应用 Ta = Tm + 3 规则，但可能需要进行优化。

注意：我们建议通过在琼脂糖凝胶上观察 2–5 μl 反应来确保 PCR 产物干净。

第二步：激酶、连接酶和DpnI（KLD）处理

1. 组装以下试剂：

2. 上下移液充分混合，在室温下孵育 5 分钟。

第三步：转型

1.在冰上解冻50μl化学感受态大肠杆菌细胞[NEB 5-α感受态大肠杆菌（高效），NEB #C2987]。

2.将步骤II中的5μlKLD混合物加入解冻的细胞管中。小心地轻弹管子 4-5 次以混合。不要涡旋。

3. 将混合物放在冰上 30 分钟。

4.在42°C下热休克30秒。

5. 放在冰上 5 分钟。

6. 将 950 μl 室温 SOC 移液到混合物中。

7. 在 37°C 下振荡 （250 rpm） 孵育 60 分钟。

8. 通过轻弹试管和倒置彻di混合细胞，然后将 50-100 μl 铺展到选择板上，并在 37°C 下孵育过夜。 可能需要（特别是对于简单的替换和删除实验）在铺板之前将 SOC 中的转化混合物稀释 10 到 40 倍，以避免菌落的草坪

产品选购：