NEBNext®Q5热启动高保真PCR Master Mix是Q5高保真DNA聚合酶的原始热启动NEBNext配方。该制剂也作为成分包含在所有用于DNA和RNA文库制备的原始NEBNext Ultra试剂盒中。

预混液中均有 Q5 超保真 DNA 聚合酶，它是一种具备热稳定性的新型 DNA 聚合酶，具有 3´→5´ 核酸外切酶活性，并且融合了具有增强持续合成能力的 Sso7d 结构域。Q5 还具有优异的保真度（比 Taq DNA 聚合酶高 280 倍），错配率极低。

这款便捷的 2X 预混液包含 dNTP、Mg++ 以及专有缓冲液，仅需加入引物和 DNA 模板，即可稳健扩增。加入热启动适配体后，可以更方便地在室温下建立反应体系。

操作使用：

1. 使用高质量、纯化的DNA模板可大大提高PCR反应的成功率。50μl反应的DNA模板推荐量如下：

2. Mg++和添加剂：

NEBNext Q5 热启动 HiFi PCR 预混液在 1X 浓度下使用时含有 2.0 mM Mg ++。这对于使用该预混液产生的大多数PCR产物是最jia选择。

3. 脱氧核苷酸：

dNTP的最终浓度经过优化，可实现稳健的文库扩增。Q5 高保真 DNA 聚合酶不能掺入 dUTP，不建议与含有尿嘧啶的引物或模板一起使用。

4. DNA聚合酶浓度：

NEBNext Q5 热启动 HiFi PCR 预混液中 DNA 聚合酶的浓度经过优化，可在各种条件下获得最佳结果。

5. 变性：

对于大多数样品类型，在 98°C 下 30 秒的初始变性就足够了。在热循环过程中，变性步骤应保持在zui低限度。通常，对于大多数模板，建议在 98°C 下变性 10 秒。

6. 退火：

对于 NEBNext 索引引物以外的 NGS 引物，Tm 可能不同。在这种情况下，在 Tm 下使用 30 秒（使用 NEB Tm 计算器），在 65°C 下使用 45 秒。

7. 外延：

推荐的延伸温度为 65°C。 对于最大 1 kb 的库，扩展时间通常为 30 秒。较大的刀片长度可能需要额外的时间。建议在 65°C 下最后一次延长 5 分钟。

8. PCR产物：

使用 NEBNext Q5 热启动 HiFi PCR 预混液生成的 PCR 产物具有钝端。

9. 磁珠兼容性：

NEBNext Q5 热启动 HiFi PCR 预混液与多种羧基化、甲苯磺酰化和链霉亲和素微珠兼容，这些微珠可继承或包含在文库构建方案的 PCR 步骤中，包括 Agencourt AMPure XP （Beckman Coulter， Inc.）、Sera-Mag SpeedBeads 和 Mag-Bind RXNPure Plus （Omega Bio-tek， Inc.）。建议使用SPRI微球或PCR纯化柱进行PCR后纯化。®®®

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