一、抗原修复技术

原理：通过高温（热修复）或蛋白酶K处理，破坏交联键，暴露被封闭的抗原表位。

方法：

热修复：将切片浸入pH 6.0柠檬酸盐缓冲液，微波加热至95℃维持15分钟。

酶消化：使用0.05%-0.1%胰蛋白酶37℃处理10-30分钟（适用于疏松组织）。

二、优化固定条件

固定剂选择：

固定时间控制：

小块组织（<5mm³）固定不超过24小时，避免过度交联。

三、穿透增强处理

去垢剂应用：0.1%-0.3% Triton X-100处理10分钟，增加细胞膜通透性。

冻融循环：将组织反复冻融（-80℃↔室温），破坏致密结构（慎用于脆弱样本）。

四、封闭内源性干扰物

内源性过氧化物酶：3% H₂O₂室温处理10分钟。

自发荧光：0.1% Sudan Black B乙醇溶液浸泡10分钟（适用于醛基固定样本）。

五、试剂与染色方案适配

抗体验证：选择经固定组织验证的一抗（查阅文献或说明书标注“IHC/IF validated"）。

染料适配：

核酸染料：优先选用抗固定型染料（如DAPI替代Hoechst）。

荧光标记：避免使用与自发荧光波长重叠的探针（如Cy5替代FITC）。

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