引言：

农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）是植物基因工程中重要的载体工具，其感受态细胞的制备质量直接影响外源基因的转化效率。本文将详细介绍农杆菌感受态细胞的标准化制备流程，结合实验优化技巧与注意事项，助您提升转化成功率，满足科研与产业化需求。

一、什么是农杆菌感受态细胞？

感受态细胞指通过物理或化学处理使细菌处于易于吸收外源DNA的状态。农杆菌感受态细胞的制备是植物转基因实验的关键步骤，直接影响Ti质粒的转化效率。目前主流方法为CaCl₂化学法，具有成本低、操作简便的优势。

二、实验材料准备

菌株选择：常用EHA105、GV3101等致病性缺失型农杆菌

培养基：YEB液体培养基（配方：5g/L牛肉膏，1g/L酵母提取物，5g/L蛋白胨，5g/L蔗糖，0.5g/L MgSO₄·7H₂O，pH7.0）

试剂：无菌0.1M CaCl₂溶液、液氮、50%甘油

设备：超净工作台、离心机、恒温摇床、-80℃冰箱

三、分步制备流程（含关键参数）

步骤1：菌种活化与扩增

取-80℃保存的农杆菌划线接种于YEB固体培养基，28℃倒置培养48小时

挑取单菌落接种至5mL YEB液体培养基，28℃、200rpm振荡培养16-18小时

优化提示：OD₆₀₀达0.4-0.6时菌体处于对数生长期，此时收获细胞活性最佳

步骤2：菌体收集与预冷处理

将菌液转移至预冷的50mL离心管，冰浴10分钟

4℃、5000g离心10分钟，弃上清

加入10mL预冷0.1M CaCl₂溶液，轻柔重悬菌体

冰浴30分钟，再次4℃离心10分钟

关键点：全程保持低温（0-4℃），防止菌膜结构受损

步骤3：感受态细胞制备

弃上清，加入2mL预冷0.1M CaCl₂溶液（含15%甘油）

轻柔吹打重悬，分装至1.5mL离心管（每管100μL）

液氮速冻1分钟后转入-80℃长期保存

配方优化：添加终浓度10mM MgCl₂可提升DNA结合效率

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