上期我们简单介绍了一下动物细胞核悬液制备试剂盒，这期我们详细介绍一下具体使用步骤吧。

一、材料

1.组织处理工具:手术剪、手术刀、镊子等

2.仪器:水平离心机、组织研磨仪、细胞计数仪。

3.试剂:RNase 抑制剂、BSA.

4.耗材:含有锆珠的研管、低吸附枪头、5mL和15mL离心管、40μm(和10μm)细胞筛.

二、动物细胞核悬液制备试剂盒使用方法

准备工作:

1、切取组织约 200mg(黄豆粒大小)

2、裂解液、前悬液和后悬液需要添加 BSA，终浓度 1%，根据样本所需试剂体积现用现配。细胞核 RNA 相关实验，实验过程中所有试剂都需要加RNase抑制剂(终浓度1U/L)，根据样本所需试剂体积现用现配。如:每1mL溶液需要加40 U/uL的RNase 抑制剂25 μL.

三、动物细胞核悬液制备试剂盒操作步骤:

1.使用移液器吸取1mL 裂解液，缓慢注入含有锆珠的研磨管中

2.迅速将细胞样本、新鲜组织或冰冻组织样本转移至上述装有裂解液和锆珠的研磨管内勇尽可能使组织块细小均匀，如图2

3.使用组织研磨仪研磨至无明显组织大块，使组织呈均匀的匀浆状，如图3.将研磨好的样本静置2~3min(时间不要超过3min)，将样本缓慢倒入40um 细胞筛中进行过滤，使用15m离心管收集滤液5.使用1~3mL前悬液冲洗研磨管和细胞筛，确保残留在其中的细胞和组织碎片被充分冲洗下来，并将冲洗液一并收集到第4步装有滤液的15m离心管中。

6.使用水平离心机，4℃，500xg，离心5min，弃上清.

7.使用前悬液重悬沉淀至300L，加入等体积(300μ)的PB1，用移液器吹打混匀。将混合后的600液转移至一新的5m离心管中。8.吸取 600LPB2,将枪头缓慢插人离心管最底层，轻柔缓慢加入PB2,使溶液自然分层,避免扰动下层溶液

9.吸取600μLPB3,将枪头缓慢插到离心管最底层，轻柔缓慢加人PB3，使溶液再次分层操作过程中要保持手部稳定，控制加入液体的速度，如图4.

10.务必使用水平离心机，并设置为居中的加速度和减速度，4°C，3000xg，离心20 min.11.离心后，缓慢取出离心管。溶液分成3层。核层位于PB2和PB3溶液交界处，移除上方碎片层(约1000L)，去除碎片层后吸取核层(约400L液体)于新的离心管中，如图4 和图 5.

12.加人5倍体积(约2mL)的后悬液，吹打混匀。

13.使用水平离心机，4℃，700xg离心5min，弃上清

14.根据所需的细胞核浓度，使用约50~2mL的后悬液将沉淀重悬。若需要较高的细胞核浓度，可选择较小体积的后悬液;若需要较低浓度，则选择较大体积的后悬液15.观察计数仪明场，若存在大于细胞核的碎片且细胞核量足够,可在保持细胞核悬液较高浓度的情况下，再经10μm 细胞筛去除杂质。若背景干净，无明显杂质，则可跳过此步骤16.质控结束后应立即进行后续相关实验。