酶联免疫吸附试验(ELISA)是一种常用的基于抗原和抗体之间特异性键的分析免疫化学测定。ELISA实验优化过程中应测试许多因素，例如用于包衣的抗原或抗体的浓度、温度、各个步骤的持续时间、包被缓冲液的类型，例如磷酸盐缓冲盐水(PBS)或碳酸盐缓冲液、样品制备方法。那么我们该如何优化ELISA实验呢？让我们一起来看看吧！
 

　　1. 抗原涂层
 

　　① ELISA的第一步是用抗原包被孔或捕获抗体。
 

　　② 大多数情况下，这包括将PBS或碳酸盐缓冲液中的蛋白质溶液应用于微量滴板孔。用于包被蛋白质的微量滴定板是具有改性表面的特殊板，即对具有极性或亲水基团的分子具有高亲和力的高电荷聚苯乙烯表面。
 

　　2. 饱和阻断
 

　　① 用抗原涂覆ELISA板的过程依赖于孔固相的结合活性，该固相将生物分子固定在孔表面。之后的步骤是阻塞。在封闭过程中，孔底部的游离结合位点被封闭缓冲液饱和，以防止非特异性结合的可能性和孔的残余结合能力，从而大大提高信噪比和特异性。如果不进行适当的封闭，检测抗体可能会与抗原非特异性结合，导致高背景信号和低灵敏度。
 

　　② 每个封闭缓冲区都代表了减少背景和保持特异性之间的折衷方案。在某些情况下，全血清和血清蛋白白蛋白可引起非特异性ELISA信号。
 

　　3. 样品制备
 

　　稀释剂的选择很重要。通常，标准稀释剂应尽可能与样品的基质相似。
 

　　① 例如，含BSA的PBS是ELISA中良好的血清替代品，常用于生物学样品。下一个重要的稀释剂成分是非离子去污剂(吐温20、TritonX-100、CHAPS)，在低浓度下，可防止非特异性(疏水性)蛋白质-蛋白质相互作用。特异性结合通常对洗涤剂更具抵抗力。
 

　　② 如果分析物不是血清，则可能需要选择与PBS/Tween/BSA不同的稀释剂。在这种情况下，有必要检查实验样品的标准曲线和稀释线性。其原因是标准稀释剂或matix的成分对抗原/抗体相互作用的影响。在这种情况下，应进行加标回收或线性稀释实验。
 

　　③ 加标回收：将一定量的标准品加入(加标)到样品缓冲液或样品中，并与未添加标准品的样品同时测量。可以比较添加到天然测试样品基质中的相同量的分析物和添加到标准稀释剂中的相同加标值。
 

　　④ 在测试实验样品时，重要的是测试几种稀释液，全部一式两份或一式三份，并结合已知标准品进行，以确保最终结果落在标准曲线的线性部分内。
 

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