一、质粒

质粒是一种环状的小分子 DNA，是进行 DNA 重组的常用载体，在分子生物学研究和基因治疗中对于质粒的产量和质量都有一定的要求，其中超螺旋比例和内毒素含量是影响质粒质量的两个重要因素。

虽然超螺旋通常是主要形式，但在所有质粒制备中，切口和线性DNA形式通常作为次要形式回收。

但是，如果操作不当的话，超螺旋形式的DNA质粒的收获率可能不高，那么如何提高质粒DNA的超螺旋比例呢？

二、提高质粒超螺旋比例的方法

（1）在生长平台期收获细菌培养物

在对数生长过程中过早收获细菌时，经常会看到带切口的 DNA。为避免分离出大量带切口的DNA，建议收获进入生长平台期（生长12-16小时后）的细菌。

（2）不要涡旋和轻轻移液

如果在质粒分离过程中将制备物涡旋或过度剧烈摇晃，则可能会因DNA的机械剪切而出现切口或线性DNA。所以建议轻轻混合，不要涡旋，轻轻少量地移液。

（3）切勿过度使用碱性裂解液

碱性裂解是从基因组DNA中分离质粒DNA关键步骤，但如果过度使用，则可能通过将质粒长久变性为单链环状形式来长久破坏质粒的超螺旋。所以建议将裂解的孵育时间保持在推荐的时间，并在此步骤中非常轻柔地混合。

（4）小心处理质粒重悬液

风干后质粒重悬期间可能会发生剪切。质粒越大，发生剪切的可能性就越大。沉淀后轻柔处理制备物，让DNA吸收到水中，而不是剧烈吹打。

（5）避免核酸内切酶

某些细菌菌株含有核酸内切酶A（endA+），可以线性化DNA。建议将质粒转化到endA–菌株中，则尽可能高效地进行质粒制备，以快速将DNA从酶中移开。

（6）保持低温

有研究表明在较低温度（4-12°C）下执行所有步骤会增加回收的超螺旋质粒的量

三、举例

如图所示，质粒提取之后进行琼脂糖凝胶电泳，开环质粒的占比约20%，说明超螺旋比例低，一般超螺旋比例需要＞90%，一般来说超螺旋比例越高，质粒的稳定性越高，高超螺旋比例的质粒在转染效率、基因表达水平等方面具有更好的表现。

原因：裂解时间不宜过长，加入裂解液后裂解时间不应超过5分钟，以免质粒受到破坏

解决方法：优化裂解时间；确保质粒的结合和所有溶液都在室温下进行，减少离心力对质粒超螺旋结构的影响，因为过度的离心可能会破坏质粒的超螺旋结构。

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