一、制备细胞生长培养基

所使用的培养基将取决于所使用的细胞类型。例如:

使用无菌技术在II级安全帽下工作。

二、在显微镜下检查细胞

在生长过程中，应该每天检查细胞，以确保它们健康并按预期生长。它们应该主要附着在烧瓶的底部，形状圆而丰满或细长，并在其膜周围折射光线。这表明他们是健康的。

介质应该是粉橙色。如果细胞大量分离和/或看起来干瘪和颗粒状/颜色深，则丢弃细胞，不要用于检测。

三、制备细胞悬浮液

1. 所有细胞处理和培养基制备应在II类安全柜中使用无菌技术进行。

2. 当细胞融合70-80%时，它们仍应处于生长的对数阶段，可用于电镀。

3. 首先将培养基在37°C水浴中加热至少30分钟。

4. 准备好后，小心地从一个175平方厘米的培养皿中倒入所需细胞的培养基（含有实验室消毒剂），注意不要增加任何滴入的污染风险。

5. 立即更换，小心地倒入100毫升预热好的新鲜培养基。

6. 使用细胞刮板，轻轻刮掉烧瓶底部的细胞到培养基中。有些细胞系可能需要胰蛋白酶化。在继续之前，检查烧瓶底部，检查所有的细胞是否脱落。

7. 确保待计数的细胞悬浮液通过轻摇瓶混合均匀。必要时可使用血清学移液管。

8. 在细胞wan全有机会沉淀之前，使用血清学移液管取出约1ml细胞悬液，并将其放置在附注管中。

9. 用血细胞计进行细胞计数。

四、获得正确的细胞密度

使用下面的计算得到正确的细胞密度。这应该是4.5 × 105个细胞/mL左右，但需要根据细胞系进行优化。

N = df

45 × 104

N是每毫升细胞数

DF是计算出来的稀释系数

由于细胞在100ml培养基中，接下来的计算是：

100 mL x稀释因子

这将给出细胞应该在的介质体积的值。

用血清学移液管加入适量的预热培养基。

例子:

如果细胞计数为55 × 104/mL，有100 mL细胞悬液：

55 × 104细胞/mL = 1.22

45 × 104细胞/mL

100毫升× 1.22 = 122毫升

因此，对于45 × 104/mL的细胞悬浮液，在100 mL细胞悬浮液中加入22 mL预热培养基。

如果正确细胞密度所需的体积小于100ml：

将细胞倒入50ml离心管中。

在离心机中以100转/分旋转10分钟，确保离心机平衡。

小心地倒出上清。

将细胞颗粒重悬于所需体积的预热培养基中。

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