1. PCR扩增

PCR-SBT技术首先是对待测DNA进行PCR扩增，以扩增出分型区域。PCR，即聚合酶链反应，是一种在体外快速扩增特定DNA片段的方法。在PCR过程中，需要设计特定的引物，它们能够与待扩增的DNA片段两端互补结合。然后，在DNA聚合酶的作用下，以dNTP为原料，按照碱基互补配对的原则，合成新的DNA链。通过多次循环的变性、退火和延伸步骤，待测DNA片段得以大量扩增。

在PCR-SBT技术中，为了扩增出HLA基因的多态性区域，通常需要设计多个引物对。这些引物对能够覆盖HLA基因的所有可变位点，确保扩增出所有可能的等位基因。通过PCR扩增，可以得到大量含有不同等位基因序列的DNA片段。

SYBR GreenⅠ染料法原理示意图

2. 序列反应

PCR扩增后的DNA片段需要进行测序，以确定它们的具体序列。在PCR-SBT技术中，一般采用Sanger测序技术，也被称为双脱氧测序法。这种测序方法基于DNA合成过程中的链终止反应。在测序反应中，向PCR扩增产物中加入四种荧光标记的双脱氧核苷酸（ddNTP），它们与正常的dNTP在结构上相似，但缺少一个羟基，因此不能继续参与DNA链的合成。当DNA聚合酶在合成过程中遇到ddNTP时，链的合成就会终止。由于ddNTP的荧光标记不同，因此可以通过荧光检测器区分出不同的终止位置，从而确定DNA序列。

3. 数据分析

测序得到的数据需要进行进一步的分析和比对。首先，需要对测序数据进行整合和预处理，确定每个可变位点的基因型组成，包括去除低质量的序列、拼接重叠的序列片段等。然后，将新测定的基因型与已知的HLA等位基因序列进行比对，以确定其种属和亚种。这一步骤需要借助专业的数据库和软件工具，如IMGT/HLA数据库等。通过比对分析，可以准确地确定待测样本的基因型别。

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