碧云天 LipoInsect转染试剂(C0551-7.5ml)是一种基于阳离子脂质体等最新转染技术的非常高效的新型昆虫细胞转染试剂。本产品转染效率高、操作简单、细胞毒性低、重复性好，达到了国际最主流昆虫细胞转染试剂的转染效果。

本产品适用于将pFastBac1等杆状病毒表达载体质粒DNA转染到Sf9、Sf21和High Five™等昆虫细胞以用于Bac-to-Bac®、BaculoDirect™和InsectSelect™表达系统的蛋白表达。LipoInsect™转染试剂操作简单，使用方法和常用的Cellfectin® II Reagent完quan一致。LipoInsect™转染试剂转染过表达质粒后，通常96小时后达到较高的蛋白表达水平。LipoInsect™转染试剂的转染效果可以通过转染表达EGFP等荧光蛋白的bacmid进行快速鉴定。

操作使用：

1. Bacmid转染：

a. 昆虫细胞培养：按照每孔约80万Sf9或Sf21细胞(具体的细胞数量据细胞类型、大小和细胞生长速度等而定)用正常的细胞培养液接种到六孔板内，使细胞密度能达到约70-90%。在27-28℃培养，后续转染和培养也在该温度下进行。

b. 15分钟后，将正常的细胞培养液更换为平板培养液(含1.5%胎牛血清不含抗生素的SFX-INSECT培养液)每孔0.8ml。

c.对于待转染的六孔板中每一个孔的细胞，取两个洁净无菌离心管，分别加入100μl不含血清和抗生素的SFX-INSECT昆虫细胞培养液用于稀释bacmid和转染试剂。其中一管加入16μg bacmid，并用枪轻轻吹打混匀；另一管加入8μl LipoInsect™转染试剂，用枪轻轻吹打混匀，或者轻微Vortex混匀，但不可离心。稀释的bacmid和转染试剂室温静置约2-5min(最多不得超过30分钟)。随即把稀释的bacmid用移液器轻轻加入到稀释的LipoInsect™转染试剂中，轻轻颠倒离心管或者用枪轻轻吹打混匀，室温静置15-30分钟。

d. 按照六孔板每孔200μl LipoInsect™转染试剂-bacmid混合物的用量，均匀滴加到整个孔内，随后轻轻混匀。

e. 为达到最高的转染效率，细胞在转染后培养3-5小时后宜更换为新鲜的wan全培养液(对于Sf9细胞，推荐在转染4小时后更换培养液)。

f. 继续在27-28℃培养约96小时后，收集每孔的培养液，500g离心5分钟，获得的上清即为P1代杆状病毒(病毒滴度通常为1×106~1×107 pfu/ml)。P1代病毒4℃避光保存，如果包装病毒时的细胞培养液为无血清培养液宜添加胎牛血清至终浓度为2%以保护病毒被蛋白酶降解。P1代病毒近期不使用的情况，可以适当分装后-80℃长期保存。尽量避免反复冻融病毒，反复冻融可能导致病毒滴度下降10-100倍。

g. 为获得更高滴度的杆状病毒，可以使用P1代病毒感染Sf9或Sf21细胞等来获得P2代杆状病毒(病毒滴度通常为1×107 ~1×108pfu/ml)。具体操作请参照昆虫细胞Bac-to-Bac Baculovious expression system的相关操作规程。大致的步骤为使用P1代病毒感染2×106个贴壁约1小时的Sf9或Sf21细胞，推荐的病毒的MOI为0.05-0.1，过高的MOI会导致获得的病毒质量下降。27-28℃培养48小时后，同步骤f收集每孔的培养液，随后500g离心5分钟，获得的上清即为P2代杆状病毒。P2代病毒的保存条件同P1代。由于杆状病毒在每一代的扩增过程中均易出现缺少突变，因此推荐最多扩增至P3代病毒。

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